Pectin-Doxorubicin Conjugates for treatment of colorectal cancer

Abstract

The objectives of this research were to develop the microbeads containing thiolatedpectin–doxorubicin (DOX) conjugates for colorectal cancer treatment. Thiolated pectin–DOXconjugates with reducible disulfide bond were synthesized from DOX–3,3-dithiopropionic acid andthiolated pectin prepared from either thioglycolic acid or cystamine dihydrochloride, using two coupling reactions, i.e., disulfide bond formation reaction and disulfide bond exchange reaction. The novel oral microbeads containing thiolated pectin–DOX conjugate were fabricated by ionotropic gelation with cations. In order to protect the microbeads from upper gastrointestinal environment, the microbeads were coated with enteric polymer. The characteristics of thiolated pectins, thiolated pectin–DOX conjugates and microbeads containing thiolated pectin–DOX conjugates were determined. The in vitro cell cytotoxicity was tested on mouse colon carcinoma, human colorectal adenocarcinoma, and human bone osteosarcoma cell lines. The in vivo anticancer efficacy of coated microbeads was confirmed in murine colon carcinoma in BALB/c mice. The results showed that the disulfide bond exchange method provided a simple, fast, and efficient approach for synthesis of thiolated pectin–DOX conjugates, compared to the disulfide bond formation method. Thiolated pectin–DOX conjugates containing disulfide bond could be cleaved at the target site in the reduction potential environment. DOX content in thiolated pectin–DOX conjugates using low methoxy pectin was found to be higher than that using high methoxy pectin. The in vitro anticancer activity of thiolated pectin–DOX conjugates was significantly higher than that of free DOX, in mouse colon carcinoma and human bone osteosarcoma cells, but insignificantly different from that of free DOX, in human prostate cancer cells. Usually, using zinc acetate as a crosslinker can produce the hardest microbeads with spherical shape, compared to other cations. However, the microbeads prepared from thiolated pectin–DOX conjugate were very soft and irregular in shape. To produce more spherical microbeads with suitable hardness, the native pectin was then added to the formulations. The particle size of the obtained microbeads ranged from 0.87 to 1.14 mm. Morphology of the microbeads was characterized by optical and scanning electron microscopy. DOX contained in the microbeads was still in crystalline form as confirmed by powder X-ray diffractometry. Drug release profiles showed that the microbeads containing thiolated pectin–DOX conjugate exhibited redox-responsive character; in reducing environments, the disulfide linkers in the thiolated pectin–DOX conjugate were cleaved and consequently DOX was released. The best-fit release kinetics of the microbeads containing thiolated pectin–DOX conjugate, in the medium without reducing agent, fit the Korsmeyer–Peppas model while those in the medium with reducing agent fit a zero-order release model. The coated microbeads containing thiolated pectin–DOX conjugate significantly inhibited the growth of all cancer cell lines. The in vivo study confirmed the delivery of DOX to colorectal tumor site, redoxresponsiveness, and anticancer efficacy of coated microbeads. The coated microbeads containing thiolated pectin–DOX conjugate also showed the ability to overcome tumor metastases and effectively inhibited primary tumor growth, without gross toxicity. No noticeable damage was found in the GI tissues of the mice, indicating lack of DOX toxicity. The findings suggest that the microbeads containing thiolated pectin–DOX conjugate is a promising platform for cancer-targeted delivery of DOX, exploiting the reducing environment typically found in tumors. Based on these results, it is proposed that the novel microbeads containing thiolated pectin–DOX conjugate could have potential for clinical delivery of DOX to the colorectal cancer site by oral administration.

วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เป็นการพัฒนาไมโครบีดบรรจุคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินสำหรับการรักษาโรคมะเร็งลำไส้ใหญ่ คอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินซึ่งมีพันธะไดซัลไฟด์ที่สามารถถูกรีดิวซ์สังเคราะห์ได้จากด็อกโซรูบิซิน–กรดไดไทโอโพรพิโอนิก และเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลซึ่งเตรียมจากกรดไทโอกลัยโคลิกหรือซิสทามีนไดไฮโดรคลอไรด์ โดยใช้ปฏิกิริยาการเชื่อมต่อ 2 ชนิด คือ ปฏิกิริยาการสร้างพันธะไดซัลไฟด์และปฏิกิริยาการแลกเปลี่ยนพันธะไดซัลไฟด์ ไมโครบีดชนิดรับประทานรูปแบบใหม่ซึ่งบรรจุคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินเตรียมจากวิธีการเกิดเจลด้วยพันธะไอออนิกโดยใช้ไอออนประจุบวก การป้องกันไมโครบีดจากสภาวะแวดล้อมของทางเดินอาหารส่วนบนทำได้โดยการเคลือบไมโครบีดด้วยเอนเทอริกพอลิเมอร์ ศึกษาลักษณะของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออล คอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซิน และไมโครบีดบรรจุคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซิน ทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ภายนอกร่างกายโดยใช้เซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่หนู เซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่มนุษย์ และเซลล์มะเร็งกระดูกของมนุษย์ และศึกษาประสิทธิภาพของไมโครบีดที่เคลือบพอลิเมอร์ในการต้านมะเร็งภายในร่างกายโดยการทดสอบในหนูทดลองที่มีมะเร็งลำไส้ใหญ่ ผลการศึกษาพบว่าวิธีการแลกเปลี่ยนพันธะไดซัลไฟด์เป็นวิธีที่ง่าย รวดเร็ว และมีประสิทธิภาพในการสังเคราะห์คอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการสร้างพันธะไดซัลไฟด์พันธะไดซัลไฟด์ของคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินถูกตัดที่บริเวณเป้ าหมายในสภาวะที่สามารถเกิดการรีดักชันได้คอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินที่เตรียมจากเพกตินที่มีหมู่เมทอกซิลต่ำกว่าห้าสิบเปอร์เซนต์มีปริมาณด็อกโซรูบิซินสูงกว่าคอนจูเกตที่เตรียมจากเพกตินที่มีหมู่เมทอกซิลสูงกว่าห้าสิบเปอร์เซนต์ ฤทธ์ิต้านมะเร็งจากการทดสอบภายนอกร่างกายของคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินสูงกว่าด็อกโซรูบิซินในรูปอิสระอย่างมีนัยสำคัญเมื่อทดสอบในเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่หนูเซลล์มะเร็งกระดูกมนุษย์ แต่ไม่พบนัยสำคัญในเซลล์มะเร็งต่อมลูกหมากมนุษย์ โดยปกติ การใช้ซิงค์อะซิเตตในการเตรียมเม็ดไมโครบีดทำให้ได้ไมโครบีดที่มีความแข็งสูงสุดและมีรูปร่างทรงกลมเมื่อเปรียบเทียบกับการใช้ไอออนบวกชนิดอื่น อย่างไรก็ตามไมโครบีดที่เตรียมจากคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินมีลักษณะนิ่มมากและไม่เป็นรูปทรง ดังนั้น เพื่อให้ได้ไมโครบีดที่มีทรงกลมมากขึ้นและมีความแข็งที่เหมาะสมจึงเติมเพกตินลงไปในสูตรตำรับ ขนาดอนุภาคของไมโครบีดที่ได้อยู่ในช่วงระหว่าง 0.87-1.14 มิลลิเมตร ลักษณะสัณฐานวิทยาของไมโครบีดศึกษาโดยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงและกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องกราด การวัดการเลี้ยวเบนของแสงเอกซเรย์ ยืนยันว่าด็อกโซรูบิซินในไมโครบีดยังคงอยู่ในรูปผลึก รูปแบบการปลดปล่อยยาจากไมโครบีดที่บรรจุคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินแสดงให้เห็นลักษณะการตอบสนองแบบรีดอกซ์ พันธะไดซัลไฟด์ในคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินสามารถแยกออกภายใต้สภาวะที่มีตัวรีดิวซ์ ทำให้ด็อกโซรูบิซินปลดปล่อยออกมา จลนศาสตร์การปลดปล่อยยาจากไมโครบีดบรรจุคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินในตัวกลางที่ไม่มีตัวรีดิวซ์สอดคล้องกับรูปแบบของ Korsmeyer–Peppas มากที่สุดในขณะที่การปลดปล่อยในตัวกลางที่มีตัวรีดิวซ์สอดคล้องกับรูปแบบการปลดปล่อยยาลำดับที่ศูนย์ ไมโครบีดบรรจุคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินที่ผ่านการเคลือบแสดงการยับยั้งเซลล์มะเร็งทุกชนิดที่นำมาทดสอบอย่างมีนัยสำคัญ การศึกษาในสัตว์ทดลองยืนยันถึงการนำส่งด็อกโซรูบิซินไปสู่ตำแหน่งมะเร็งลำไส้ใหญ่ การตอบสนองต่อสภาวะรีดอกซ์ และประสิทธิภาพในการต้านมะเร็งของไมโครบีดที่ผ่านการเคลือบ ไมโครบีดที่บรรจุคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินที่ผ่านการเคลือบยังแสดงถึงความสามารถในการยับยั้งการกระจายของมะเร็งและความมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งที่ตำแหน่งปฐมภูมิโดยปราศจากความเป็นพิษอย่างสูง การไม่พบความเสียหายในเนื้อเยื่อทางเดินอาหารของหนูแสดงถึงความไม่เป็นพิษของด็อกโซรูบิซิน จากสิ่งที่ค้นพบสามารถ สรุปได้ว่าไมโครบีดที่บรรจุคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินเป็นรูปแบบที่สามารถนำมาใช้กับการนำส่งด็อกโซรูบิซินแบบมุ่งเป้ าไปยังตำแหน่งมะเร็งโดยใช้ประโยชน์จากสภาวะแวดล้อมที่พบได้ในมะเร็ง ผลการศึกษายังสามารถบ่งชี้ได้ว่าไมโครบีดบรรจุคอนจูเกตของเพกตินที่มีการเติมหมู่ไทออลกับด็อกโซรูบิซินมีศักยภาพสำหรับการนำส่งด็อกโซรูบิซินในทางคลินิกไปยังตำแหน่งมะเร็งลำไส้ใหญ่ผ่านการบริหารยาโดยวิธีการรับประทาน